O metodă nouă permite vizualizarea a opt proteine într-o singură celulă, printr-o singură etapă de marcare
O colaborare internațională condusă de Centrul Medical Universitar Göttingen (UMG) din Germania a dezvoltat o metodă de marcare care distinge etichetele fluorescente nu după culoare, ci după durata de emisie a fluorescenței. Astfel, opt proteine diferite pot fi vizualizate simultan într-o celulă, într-o singură etapă, folosind microscoape standard. Rezultatele au fost publicate în revista ACS Nano.
Microscopia de fluorescență este o metodă importantă în cercetarea biomedicală, permițând vizualizarea proteinelor și structurilor celulare specifice. De obicei, cercetătorii folosesc anticorpi purtători de coloranți fluorescenti pentru a marca proteinele de interes. Când sunt excitați, coloranții emit fluorescență, iar microscopul detectează lumina emisă. Problema este că microscoapele convenționale pot detecta doar trei sau patru culori simultan — de exemplu albastru/violet, verde, galben/portocaliu și roșu — astfel încât doar acest număr de proteine pot fi distinse în același timp.
O echipă internațională de cercetare condusă de dr. Felipe Opazo, lider de grup de cercetare la Departamentul de Neuro- și Fiziologie Senzorială și la Centrul pentru Imagistică Biostructurală a Neurodegenerării (BIN) de la Centrul Medical Universitar Göttingen (UMG), împreună cu dr. Roman Tsukanov, cercetător postdoctoral la al Treilea Institut de Fizică al Universității din Göttingen, a deschis acum o a doua dimensiune. Pe lângă culoare, cercetătorii folosesc o proprietate rareori exploatată până acum: durata de viață a fluorescenței, cele câteva miliardimi de secundă cât strălucește un colorant după excitarea cu laser.
„Două etichete pot părea identice ca și culoare și totuși pot fi separate clar, pentru că una fluorescează măsurabil mai mult decât cealaltă. Este puțin ca și cum ai distinge două instrumente nu după înălțimea notei, ci după cât de repede se stinge sunetul”, explică Opazo, care a conceput și condus studiul. „A fost important pentru noi ca metoda să poată fi implementată cu ușurință pe microscoape confocale convenționale echipate cu detecție a duratei de viață a fluorescenței. Nu necesită o platformă de microscopie specializată”, a adăugat Tsukanov, de asemenea autor senior al studiului.
Un buzunar proteic reglează „cronometrul”
Trucul constă în mediul înconjurător al coloranților fluorescenti. Timpul necesar unui colorant să înceapă să strălucească depinde de mediul său chimic imediat. Spre deosebire de alte metode, coloranții se află aici într-un „buzunar” proteic care există în patru variante modificate genetic. Fiecare buzunar conferă unei molecule de colorant o durată de viață a fluorescenței unică. În teorie, patru proteine țintă diferite pot fi detectate simultan folosind doar un colorant fluorescent roșu: fiecare variantă de buzunar produce o durată de viață distinctă, deși toate patru ar apărea roșii în dimensiunea de culoare.
Buzunarul proteic este cuplat la nanobody. Acești anticorpi miniaturali, derivați din alpaca, au aproximativ o zecime din dimensiunea unui anticorp convențional și se conectează ușor la buzunarele proteice. Mulți anticorpi convenționali recunosc deja o mare varietate de proteine țintă. Acești anticorpi pot găsi o proteină de interes, în timp ce nanobody cuplate la buzunare proteice purtătoare de colorant relevă locația anticorpilor și, astfel, a proteinei. În acest fel, nanobody pot transfera „codul” duratei de viață a fluorescenței către orice anticorp utilizat în mod obișnuit într-un laborator.
Câștigul practic este considerabil. Spre deosebire de alte metode convenționale, anticorpii sunt preasamblați cu nanobody înainte de marcare, permițând marcarea tuturor țintelor într-o singură etapă. Pentru studiu, echipa a măsurat sistematic 26 de coloranți în cele patru variante de buzunar și a compilat rezultatele într-un catalog din care pot fi selectate combinații adecvate. Cercetătorii au numit metoda NanoFLex: multiplexare prin durata de viață a fluorescenței ghidată de nanobody.
Perspective pentru examinarea țesuturilor și biopsii
Abordarea ar putea fi deosebit de utilă pentru probele clinice. Țesutul uman are o strălucire naturală de fond care interferează cu multe metode de marcare. Cu toate acestea, durata de viață a acestei autofluorescențe poate fi distinsă cu ușurință de cea a semnalelor reale. Împreună cu capacitatea de a citi mulți markeri dintr-o singură secțiune sau probă, acest lucru face metoda atractivă pentru analiza biopsiilor, unde materialul este limitat și prețios.
Autorii se așteaptă ca numărul de proteine detectabile simultan să crească în continuare pe măsură ce devin disponibili noi coloranți și metode computaționale îmbunătățite de analiză.
