Testul fluorescent accelerează screening-ul a mii de variante enzimatice care modifică compușii vegetali
Multe compuși naturali din plante au proprietăți promițătoare pentru sănătate, dar solubilitatea lor scăzută în apă poate limita cât de eficient sunt absorbiți și utilizați. În lucrări anterioare, cercetătorii au descoperit o enzimă din Bacillus subtilis, numită fenol fosfat sintetază (BsPPS), care poate atașa grupări fosfat unei game largi de compuși fenolici. Această modificare poate contribui la creșterea solubilității în apă a acestor compuși și sprijină dezvoltarea de nutraceutice îmbunătățite și produse conexe.
Pentru a face BsPPS mai utilă și pentru a explora alte enzime similare care fosforilează compuși fenolici, este nevoie de o metodă rapidă și convenabilă de măsurare a activității enzimatice. Acest lucru este deosebit de important deoarece BsPPS reprezintă un grup nou caracterizat de enzime capabile să fosforileze diverși compuși fenolici. Metodele analitice convenționale, precum HPLC, pot măsura cu precizie produșii, dar sunt prea lente și consumatoare de timp pentru screening-ul a mii de probe.
Pierderea fluorescenței semnalează activitatea enzimatică
Într-un studiu publicat în Food Chemistry, cercetătorii au dezvoltat o metodă de screening bazată pe fluorescență, folosind umbeliferona (UMB), un compus fluorescent de mici dimensiuni, ca indicator al activității BsPPS. UMB produce în mod normal un semnal fluorescent puternic. Când BsPPS adaugă o grupare fosfat la UMB, producând umbeliferonă 7-fosfat (U7P), fluorescența scade semnificativ. Măsurând această scădere cu un cititor standard de microplăci, oamenii de știință pot estima rapid cât de activă este enzima.
Screening pentru variante enzimatice tolerante la căldură
Cercetătorii au optimizat sistematic condițiile de măsurare și au confirmat că metoda este precisă, reproductibilă și adecvată pentru testarea multor probe în paralel. De asemenea, au combinat testul cu evoluția dirijată, o tehnică prin care sunt generate multe versiuni ușor diferite ale unei enzime și sunt testate pentru proprietăți utile.
Folosind această abordare, au fost testate mii de variante ale BsPPS și a fost identificată o variantă numită G145D, care a păstrat mai multă activitate după tratamentul termic decât enzima originală, menținând în același timp o performanță catalitică similară.
În ansamblu, acest test bazat pe fluorescență oferă o platformă practică pentru screening-ul rapid și ingineria BsPPS. De asemenea, sprijină explorarea viitoare a enzimelor similare care fosforilează compuși fenolici și facilitează dezvoltarea de biocatalizatori îmbunătățiți pentru producerea de derivați fosforilați solubili în apă ai compușilor bioactivi de origine vegetală.
„Transformând activitatea enzimatică într-un semnal fluorescent ușor de măsurat, putem examina mii de variante enzimatice mult mai eficient, putem accelera dezvoltarea de biocatalizatori îmbunătățiți și putem facilita explorarea enzimelor care fosforilează compuși fenolici”, spune autorul corespondent Nan-Wei Su, profesor de chimie agricolă la Universitatea Națională Taiwan.
