Cercetătorii dezvoltă un sistem care îmbunătățește editarea genomică de precizie la plantele dicotiledonate
Un nou sistem de editare genetică ar putea facilita introducerea unor modificări genetice precise în culturi precum tomatele, soia și rapița. Dezvoltat de cercetători din China, SmartPE îmbunătățește eficiența editării de precizie (prime editing) la mai multe plante dicotiledonate, abordând o limitare majoră a acestei tehnici.
Noul sistem introduce nepotriviri (mismatch-uri) în șabloanele revers-transcriptazei (RTT) a două ARN-uri ghid pentru editarea de precizie (pegRNA), combinând această strategie cu un element de reglare cis și o revers-transcriptază modificată genetic. Studiul, condus de profesorul Gao Caixia de la Institutul de Genetică și Biologie a Dezvoltării din cadrul Academiei Chineze de Științe, a fost publicat în Nature Plants pe 28 octombrie.
Depășirea eficienței scăzute de editare
Editarea de precizie poate introduce substituții de baze și inserții sau deleții mici fără a produce rupturi duble ale catenei de ADN și fără a necesita un șablon donor, cu relativ puține evenimente off-target și produse secundare. La plantele dicotiledonate, însă, eficiența sa este scăzută și variază considerabil între situsurile-țintă.
În cadrul studiului, cercetătorii au inserat mai întâi elemente de reglare cis între promotor și secvența codificatoare a Cas9 pentru a crește expresia editorului. Elementul START s-a dovedit cel mai performant, ridicând nivelurile de transcript de 2,1 ori și eficiența de editare la patru ținte din Arabidopsis cu aproximativ 1,8 ori.
Pornind de la această îmbunătățire, echipa a testat o strategie cu două pegRNA, dar eficiența editării nu a crescut. Cercetătorii au presupus că împerecherea complementară dintre RTT și ADN-ul genomic poate împiedica revers-transcripția și că repararea nepotrivirilor (MMR) suprimă editarea de precizie. Prin urmare, au introdus baze nepotrivite complementare în RTT-urile ambelor pegRNA. Această modificare a crescut activitatea medie de editare la cele patru ținte de peste șase ori, ajungând la aproximativ 10%. Sistemul rezultat a fost numit SmartPE.
Amplasarea nepotrivirilor influențează succesul editării
Echipa a examinat în continuare modul în care ar trebui aranjate nepotrivirile. Nepotrivirile continue sau cele distanțate la 3 pb au oferit cea mai mare eficiență de editare (până la 20%), în timp ce intervalele de 6 pb sau mai mari au redus brusc eficiența. Acest model a diferit de cel observat în sistemele cu un singur pegRNA. Nepotrivirile de la ambele capete ale ferestrei de editare au îmbunătățit eficiența, în timp ce cele din mijloc nu au făcut-o, ceea ce sugerează că amplasarea nepotrivirilor poate influența inițierea revers-transcripției.
În celulele U2OS și HeLa, proteina SB care inhibă MMR a îmbunătățit editarea cu un singur pegRNA, dar nu și SmartPE. Aceste rezultate indică faptul că cele două strategii se bazează pe căi de reparare diferite, deși mecanismul molecular de bază rămâne să fie elucidat în continuare.
Eficiențe mai mari la țintele din culturi agricole
În protoplaste, șase din nouă ținte din tomate au depășit 10% eficiență, nouă din 11 ținte din soia au depășit 5%, iar cinci ținte din rapiță au atins sau depășit aproximativ 10%. Editarea de precizie convențională a fost aproape inactivă la unele dintre aceste ținte. Folosind substituții sinonime pentru a crea nepotriviri în RTT, echipa a generat substituții de un singur aminoacid la ținte din soia și tomate, cu eficiențe de 1,6 până la 11,1 ori mai mari.
În experimentele de transformare stabilă, SmartPE a produs editări homozigote (7,3%) și heterozigote (12,5%) la locusul SlOR2 din rădăcinile păroase de tomate, comparativ cu doar editări heterozigote (1,0%) și chimeri în cazul editării de precizie standard. La Arabidopsis și tomate, sistemul a realizat inserții fără cusur de etichete FLAG, enhanceri și situsuri de recombinare cu o eficiență de până la 32% (17% co-editare la două ținte). La soia, până în prezent au fost obținuți doar chimeri, ceea ce indică necesitatea unor investigații suplimentare.
În ansamblu, SmartPE îmbunătățește eficiența editării de precizie la mai multe plante dicotiledonate, inclusiv Arabidopsis, tomate, soia și rapiță. Principiile de proiectare empirică privind densitatea și distribuția nepotrivirilor oferă un cadru practic pentru aplicarea editorilor de precizie în culturile dicotiledonate.
