O nouă metodă de imagistică fluorescentă urmărește metabolismul celular în timp real
Cercetătorii de la Universitatea Cornell au dezvoltat o formă mai rapidă de imagistică prin fluorescență cu doi fotoni, capabilă să observe metabolismul celulelor în timp real. Metoda ar putea permite screening-ul mai rapid al noilor tratamente terapeutice, potrivit unui studiu publicat pe 4 septembrie în revista Science Advances.
Autorii principali ai lucrării sunt Lu Ling, fost cercetător postdoctoral, și Jack Crowley, student la doctorat. Ling a inițiat proiectul în laboratorulClaudiei Fischbach, director al Școlii Meinig de Inginerie Biomedicală și profesor de inginerie biomedicală la Cornell Duffield College of Engineering.
„Vrem să studiem metabolismul cancerului, dar este un proces foarte dinamic. Totul se poate întâmpla în câteva minute sau ore, așa că nu exista o modalitate bună de a urmări dinamica fiecărei celule cu instrumentele pe care le aveam la acea vreme”, a declarat Ling. „Ideea a fost: putem face ceva mai bun decât metodele standard?”, a adăugat ea.
Limitările expunerii prelungite la lumină
Fischbach și Ling l-au contactat pe Warren Zipfel, profesor asociat de inginerie biomedicală în cadrul Duffield Engineering, specializat în microscopie optică pentru cercetare biomedicală. Fischbach era interesată în special de microscopia de imagistică prin durata de viață a fluorescenței (FLIM), o metodă comună de monitorizare a metabolismului bazată pe fluorescența NADH din celule. NADH este o moleculă esențială care transportă energia brută obținută din alimente direct către mașinăria celulară care produce energie.
FLIM funcționează prin excitarea moleculelor și măsurarea duratei cât acestea rămân excitate înainte de a-și elibera energia sub formă de lumină fluorescentă. Întârzierea detectată a fotonilor de fluorescență dezvăluie informații despre mediul local și comportamentul moleculei.
Zipfel a argumentat însă că FLIM nu este ideal pentru corelarea mișcării celulelor cu schimbările metabolice, deoarece celulele trebuie imaginate la multiple momente de-a lungul unor perioade extinse, iar expunerea excesivă la lumină reprezintă un stres serios pentru celule.
Polarizarea dezvăluie rotația moleculară
În metoda dezvoltată de echipă, microscopia ratiometrică prin polarizarea fluorescenței cu doi fotoni (FPRM), un microscop cu scanare laser balansează lumină polarizată și focalizată peste celule, apoi folosește un separator de fascicul polarizant pentru a împărți fluorescența simultan către doi detectori. Aceasta oferă o măsură a vitezei de rotație a moleculelor emitente.
O rotație mai lentă, cu fluorescența emisă fiind puternic polarizată, indică faptul că mai multe molecule de NADH pot fi legate de proteine și, prin urmare, ar putea indica generarea de energie în acea parte a celulei. Între timp, moleculele de NADH nelegate se rotesc mai liber, cu o emisie depolarizată.
„Acest nivel de bias către o stare polarizată este citirea noastră înlocuind experimentul de temporizare a fotonilor, care necesită instrumentație mult mai complicată”, a declarat Crowley, care a preluat proiectul când Ling a plecat pentru a-și continua cercetarea postdoctorală la Universitatea din California, Berkeley. „Este o modalitate de a ne oferi informații similare cu cele pe care le-am putea obține folosind FLIM, dar mult mai rapid și cu mult mai puțină lumină.”
Deși instrumentația FPRM nu este la fel de complicată ca cea FLIM, experimentele au produs date dificil de interpretat și au necesitat metode noi de analiză și calibrare, precum și numeroase experimente de control.
Extinderea experimentelor în țesuturi tridimensionale
Pe lângă celulele canceroase, microscopia cu doi fotoni este potrivită pentru imagistica sistemelor tisulare tridimensionale complexe, inclusiv organoizi și organisme model.
„Dacă studiezi celulele în medii tridimensionale, acestea se comportă mai asemănător cu modul în care o fac în corpul uman sau în starea de boală pe care încercăm să o modelăm prin cercetarea noastră”, a declarat Crowley. „Așadar, orice oportunitate de a oferi noi strategii de măsurare, în special cele mai simple și mai ieftine, înseamnă că mai mulți oameni pot imagina experimente diverse care urmăresc răspunsuri dinamice în structuri tisulare inginerești tridimensionale complexe. Și cred că acest lucru va fi extraordinar pentru cercetare în general.”
