O compresie scurtă a nucleului crește eficiența reprogramării celulare cu CRISPRa
O echipă de cercetători de la UCLA a găsit o soluție fizică pentru una dintre cele mai încăpățânate bariere ale reprogramării celulare: accesul instrumentelor de activare genică la secvențele de ADN ascunse în nucleu. Studiul, publicat în revista Matter, arată că o compresie de doar câteva milisecunde poate relaxa temporar ambalajul dens al ADN-ului, permițând sistemului CRISPRa să activeze gene pe care altfel nu le-ar putea atinge.
Fiecare celulă umană conține aproximativ doi metri de ADN, pliat și compactat pentru a încăpea în nucleu. Organizarea este esențială pentru viață, dar creează o problemă: genele care controlează identitatea unei celule sunt adesea îngropate atât de adânc în cromatina densă încât instrumentele de direcționare genomică ajung greu la ele. Reprogramarea celulară – transformarea celulelor de piele în neuroni, celule cardiace sau alte tipuri greu de obținut – rămâne astfel foarte ineficientă. În celulele de șoarece se convertesc adesea doar câteva procente, iar în cele umane rata poate coborî sub un procent.
Abordarea echipei conduse de Song Li, profesor de bioinginerie la UCLA Samueli School of Engineering, pornește de la o constatare anterioară a laboratorului: o compresie scurtă a nucleului celulelor de piele relaxează ambalajul ADN-ului și îmbunătățește reprogramarea. Noul studiu identifică precis regiunile genomului care devin mai accesibile după compresie și folosește această hartă pentru a ghida CRISPRa. Combinația dintre cartografierea la nivel de genom și activarea țintită a genelor a dus la o strategie botezată MECA – activare mediată de CRISPR cu amplificare mecanică.
„Chiar și atunci când factorii de reprogramare sunt în interiorul celulei, problema ultimei mile este că nu pot ajunge la siturile pe care trebuie să se lege pentru a activa genele”, a explicat Li. „Abordăm această problemă a ultimei mile, care este accesibilitatea.”
În experimente, CRISPRa și ARN-urile sale ghid au fost livrate celulelor de piele de șoarece adult sub formă de ARN cu viață scurtă, nu prin virus, evitând astfel riscurile de siguranță asociate acestei metode. Deoarece instrumentul nu taie ADN-ul, genele au putut fi activate fără modificări permanente. La o zi după livrare, celulele au trecut printr-un cip microfluidic cu canale mai înguste decât nucleele, care le-au comprimat și deformat scurt.
Compresia a afectat numeroase gene, inclusiv Ascl1 și Brn2, capabile să îndrume o celulă de piele spre stadiul de neuron. Efectul a fost cel mai puternic atunci când ghidurile ARN au fost direcționate către siturile deschise de compresie. Astfel, aproximativ 10% dintre celulele de piele au devenit neuroni, față de circa 3% cu CRISPRa singur.
Compresia în sine nu schimbă identitatea celulei; ea deschide doar o fereastră în care CRISPRa poate acționa mai ușor. „Este ca și cum ai da celulei puțin exercițiu, ca să aibă mai multă plasticitate”, a spus Li.
În etapa următoare, echipa a folosit aceeași abordare pentru a activa Oct4, o genă care ajută celulele stem să rămână flexibile. Cu compresia, mult mai multe celule de piele au activat Oct4, apropiindu-se parțial de o stare asemănătoare celulelor stem, fără a deveni complet celule stem. Mai multe dintre ele se divideau, iar ADN-ul lor era mai puțin compact. Când cercetătorii au activat apoi Ascl1 și Brn2 în aceste celule, aproximativ 40% au devenit neuroni, mult mai mult decât cu compresia și CRISPRa folosite separat.
MECA nu depinde de o singură modalitate de livrare a CRISPRa în celule, pentru că rezolvă o problemă distinctă: accesibilitatea ADN-ului din nucleu. Metoda oferă totodată cercetătorilor un mod rațional de a alege țintele – regiunile genomului care devin accesibile după compresie. Echipa plănuiește să testeze dacă abordarea funcționează și pentru alte conversii de celule umane și dacă celulele rezultate sunt suficient de funcționale pentru aplicații precum testarea medicamentelor și transplantul.
Cercetătorii au observat în plus că activarea Oct4 prin această metodă a făcut ca celulele de piele provenite de la șoareci bătrâni să pară biologic mai tinere, judecând după tiparele chimice ale ADN-ului folosite pentru estimarea vârstei. Alte câteva semne ale îmbătrânirii celulare s-au ameliorat de asemenea, ceea ce sugerează că reglarea mecanică a genelor ar putea fi utilă în studiul îmbătrânirii și al posibilei sale inversări.
Rezultatele se adaugă dovezilor tot mai numeroase că forțele fizice influențează comportamentul genomului. „Celulele din corpul nostru simt forțe fizice în fiecare secundă, de la întinderea unui mușchi la încărcarea unui os, la fel cum răspund la semnale chimice”, a concluzionat Li. „Așadar, acest lucru ar trebui studiat împreună cu factorii chimici și biologici.”
