Cercetătorii îmbunătățesc extracția ARN din feliile pulmonare de precizie
Feliile pulmonare de precizie le permit cercetătorilor să studieze țesut pulmonar uman viu în afara organismului, păstrând diferitele tipuri de celule și structurile care alcătuiesc organul. Însă o substanță care îi ajută pe oamenii de știință să creeze aceste felii poate îngreuna și analiza activității genetice din interiorul lor.
Cercetătorii de la Școala de Medicină Yale au dezvoltat două metode pentru a rezolva această problemă, crescând cantitatea și integritatea ARN-ului recuperabil din feliile pulmonare de precizie (PCLS). Studiul, publicat în American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, arată cum modificarea procesului de extracție a ARN-ului poate înlătura interferența agarozEI reziduale, un gel necesar pentru prepararea feliilor.
Pentru a obține feliile, cercetătorii umflă plămâni umani donați cu agaroză, pentru a oferi suport structural țesuturilor moi și poroase, care astfel pot fi tăiate în felii subțiri. Probele rezultate păstrează mai multe tipuri de celule și structuri pulmonare, ceea ce le permite cercetătorilor să observe cum celulele interacționează și răspund la tratamentele experimentale.
„Faptul că în țesut există diferite tipuri de celule este foarte util pentru studierea modului în care celulele interacționează și răspund unele altora, pentru că celulele din organele noastre sunt construite să comunice între ele”, a declarat Reina Rangel, primul autor al studiului și cercetător asociat în Secția de Pneumologie, Terapie Intensivă și Medicină a Somnului din cadrul Yale.
Agaroza implică însă un compromis. „Agaroza este extrem de utilă pentru că ne permite să tăiem feliile în primul rând”, a spus Rangel. „Dar devine o barieră care ne împiedică să facem anumite lucruri ulterioare.”
În special, agarozA reziduală poate interfera cu extracția ARN-ului, moleculele analizate pentru a înțelege expresia genelor. Extracția convențională a produs cantități de ARN sub pragul de detectare al studiului și o integritate substanțial mai scăzută decât ambele abordări alternative testate.
Rangel a abordat problema pornind de la originile biologice ale agarozEI. Deoarece agaroza este un polizaharid derivat din alge marine, ea s-a întrebat dacă instrumentele concepute pentru extracția ARN-ului din țesuturi vegetale, care conțin și ele carbohidrați complecși, ar putea funcționa pentru probele pulmonare. „M-am gândit mai mult ca un biolog”, a spus ea. „Mă interesa ce este de fapt agaroza și dacă exista ceva ce aș putea folosi în avantajul meu.”
În timp ce Rangel a urmat abordarea bazată pe kituri pentru plante, Joan Marti-Munoz, cercetător asociat și autorul corespondent al studiului, a căutat o modalitate de a elimina agaroza înainte de extracția ARN-ului. Marti-Munoz a folosit un tampon de dizolvare a agarozEI, utilizat în mod obișnuit pentru purificarea acizilor nucleici în electroforeză pe gel.
Ambele metode au îmbunătățit recuperarea ARN-ului, iar metoda de dizolvare a agarozEI a produs cel mai mare randament și cea mai bună integritate. „Am căutat o modalitate de a dizolva agaroza din PCLS înainte de a extrage ARN-ul și am constatat că un tampon folosit frecvent în electroforeză pe gel funcționează bine”, a spus Marti-Munoz.
Pentru echipă, una dintre cele mai importante îmbunătățiri a fost fiabilitatea. Anterior, cercetătorii puteau pregăti mai multe felii pentru analiza ARN-ului, pentru ca apoi să piardă unele din cauza eșecului extracției. „Acum, când ne proiectăm experimentele, putem spune «vrem cinci probe pentru extracția ARN-ului» și vom primi efectiv cinci probe de ARN”, a spus Rangel.
ARN-ul mai fiabil și intact le permite cercetătorilor să folosească feliile pulmonare de precizie pentru analize complexe, precum secvențierea ARN-ului, comparând totodată modul în care țesutul de la același donator uman răspunde la tratamente experimentale diferite. Acest lucru ar putea fi util mai ales pentru studierea fibrozei pulmonare și evaluarea potențialelor terapii.
„Obținerea unui ARN de înaltă calitate este esențială pentru studii semnificative ale expresiei genelor, iar metoda noastră îi ajută pe cercetători să atingă acest obiectiv”, a spus Marti-Munoz. Prin examinarea modificărilor expresiei genelor, cercetătorii pot înțelege mai bine modul în care țesutul pulmonar răspunde la medicamentele experimentale. În boli precum fibroza pulmonară, care provoacă cicatrizarea plămânilor, aceste analize ar putea ajuta oamenii de știință să evalueze dacă tratamentele potențiale au efectele dorite.
„Țesutul uman este valoros pentru cercetarea noastră, pentru că atunci când proiectăm medicamente, vrem ca ele să funcționeze la oameni”, a spus Rangel. „Feliile pulmonare de precizie îți permit să obții mai multe probe de la aceeași persoană, oferindu-le cercetătorilor instrumente mai bune pentru a răspunde la întrebări pe care le considerăm foarte importante.”
